浊度法测定12-去羟基阿奇霉素的效价

来源：https://www.shuizhifenxi.com/ 作者：余氯检测仪 时间：2019-01-04

　　【摘要】 目的 建立浊度法测定12.去羟基阿奇霉素效价的方法。方法 以肺炎克雷伯菌为试验菌，加菌量0.6%~1.0%(V/V)，37℃±0.5℃培养4 h左右测定。结果 抗生素线性浓度为2.0~10.0 U/ml，二剂量法原料的平均回收率为101.2%，RSD为2.2%(n=9)。结论 本方法灵敏，快速，影响因素较少，可作为测定12.去羟基阿奇霉素的效价的方法。

　　【关键词】 效价;浊度法;12.去羟基阿奇霉素

　　12-去羟基阿奇霉素是由红霉素C为原料，通过化学合成的方法合成的。本药物属广谱抗菌药， 对大多数革兰阴性细菌以及细胞内病原菌、支原体和衣原体等有较好的抗菌活性，对革兰氏阳性细菌也有一定的抗菌活性。其抗菌活性较阿奇霉素为强。

　　本药物属于新药，目前尚无含量测定方法。本文建立了浊度法测定12.去羟基阿奇霉素效价的方法。通过对12.去羟基阿奇霉素用比浊法测定其效价的研究，即可直观反应药物的抗菌活力，又可在检测当天获得实验结果。

　　1 仪器与试剂

　　CBZ.1抗生素光度比浊法测量仪、石英培养杯(厚度1 cm)，北京潮声公司。

　　肺炎克雷伯菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 103]，由中国药品生物制品检定所提供。

　　阿奇霉素标准品(批号：130352.200405含量：936 U/mg)由中国药品生物制品检定所提供。12.去羟基阿奇霉素(河北省药品检验所自主合成)。

　　抗生素检定培养基Ⅲ号(pH7.8，批号060403)由北京三药科技开发公司提供(中国药品生物制品检定所监制);灭菌0.9%氯化钠溶液和磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)均按中国药典2005年版二部附录配制。

　　2 方法与结果

　　2.1 一剂量法

　　2.1.1 菌液的配制 取肺炎克雷伯菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35℃~37℃培养18~22 h，临用时，用0.9%灭菌氯化钠溶液洗下;取新鲜的菌悬液适量，加12%甲醛液1 ml杀灭，加生理盐水做适当的稀释，使得其在580 nm波长处的吸收值为1.0，记录其稀释所用的生理盐水的毫升数和1 ml 12%甲醛液的总毫升数，再将原菌液按此比例稀释，即为试验菌液。取试验菌液0.6~1.0 ml加至培养基100 ml中，摇匀，为实验菌液。

　　2.1.2 溶液的配制 标准品溶液取阿奇霉素标准品适量，精密称取，加乙醇溶解并用水稀释成1 000 μg/ml的溶液，作为储备液备用;精密量取储备液适量，用磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)进一步稀释成2、4、5、8、10 U/ml的标准品溶液。

　　2.1.3 培养与测定 取标准品溶液1.0 ml，加入灭菌培养管中，再加入实验菌液9.0 ml，置抗生素比浊法测量仪内，于37℃培养。另取稀释溶剂1.0 ml，加空白培养基9.0 ml，混匀，作为空白对照，仪器在线于530 nm的波长处测定各管肺炎克雷伯菌对数生长期内不同培养时间下的吸光度值(A)。根据量反应平行线原理计算供试品的效价值。

　　2.2 二剂量法

　　2.2.1 溶液的配制 ①标准品溶液精密量取阿奇霉素标准品储备液适量，用磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)稀释制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的标准品溶液;②供试品溶液取12.去羟基阿奇霉素适量，加乙醇溶解并用水稀释成1 000 μg/ml的溶液，作为储备液备用;精密量取12.去羟基阿奇霉素储备液适量，用磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)稀释制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的供试品溶液。

　　2.2.2 菌液的配制 同2.1.2项下制备方法。

　　2.2.3 培养与测定 同2.1.3项下方法。

　　2.3 线性与范围的测定 照抗生素微生物检定一剂量法测定，并以各组浓度标准品溶液所致菌液吸收度的值对溶液对数浓度进行线性回归，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数分别为：

　　回归直线方程 Y=bX+a=.0.471 5 X+0.832 6相关系数r=0.995 5。

　　结果表明：采用标准品溶液进行一剂量法试验，在2~10 U/ml的浓度范围里，呈良好的线性关系。

　　2.4 回收率试验 精密称取阿奇霉素标准品及一批已知含量的12.去羟基阿奇霉素原料样品，精密称定，加乙醇溶解并用水稀释成800、1 000、1 200 U/ml的溶液，作为储备液备用;精密量取储备液适量，用磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)稀释制成3.2和6.4 U/ml、4.0和8.0 U/ml、5.0和10.0 U/ml的供试品溶液。在上述条件下测定，测得回收率结果为平均加样回收率为101.2%，RSD为2.2%(n=9)。

　　2.5 重复性试验 用已知含量的12.去羟基阿奇霉素样品一批，共测定6次，结果平均含量为950 U/mg，RSD为1.8%。

　　2.6 稳定性考察 主要考察了抗生素溶液，即贮备溶液和测定溶液稳定性对测定结果的影响。

　　结果表明：本品的浓溶液和点样用稀溶液放置冰箱保存可稳定2 d，完全可以满足实验的需要。

　　2.7 专属性考察 采用回收率试验进行验证，结果见2.4。

　　2.8 样品测定 按上述浊度法测定法的二剂量法，进行试验，结果见表1。

　　3 讨论

　　3.1 测定条件的选择

　　3.1.1 实验菌、培养基及加菌量的选择 12.去羟基阿奇霉素为广谱抗生素，对大多数革兰氏阴性细菌敏感，对革兰氏阳性细菌也有一定的抗菌活性。曾选用金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌同时作实验，发现肺炎克雷伯菌对于本品种来说更为敏感。因此，本研究选择肺炎克雷伯菌作为实验菌。培养基采用国内外药典通用的抗生素检定培养基Ⅲ号，pH为7.0，灭菌后为澄清的液体培养基，适合肺炎克雷伯菌生长。

　　菌液浓度：比浊侧定时，菌液过浓亦可使浓度.吸收度不成直线关系;但菌液浓度过稀，则读数偏低，误差增大。一般控制吸收度读数在0.3~0.7较为适宜。

　　3.1.2 测定时间的选择 采用试验菌的不同传代次数(3、4、5代)及不同加菌量(0.6~1.0%)，以不同抗生素浓度试验，观察试验菌的生长曲线。发现，在4 h左右可达到所需浓度范围(即培养一定时间后，吸光度应在0.3~0.7，剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1)。

　　3.1.3 时间的一致性 主要是使每管的培养时间相等，实验时在试管中加入含试验菌液的培养基后，应立即加入标准品溶液和供试品溶液，混合均匀。必要时可先将培养基冷却至2℃~4℃左右，再接种菌种，并在此温度下，将含菌培养基加至各试管中，可避免加注试管先后的误差。培养终止时原应将各管同时放入冰浴中，并尽快加入甲醛溶液灭活，使各试验管的培养时间一致，现采用仪器在线测定，则不需此项操作。

　　3.2 浊度法具有快速(试验过程3~4 h，加上其他操作，可在当天获得结果)，易于操作，结果用仪器测定，便于自动化操作等优点;更重要的是采用液体培养基，消除了多组分抗生素在固体培养基中扩散不同的影响，使得试验的灵敏度高，精密度和准确度都较琼脂扩散法好。但浊度法对试验仪器的性能及试验器具的要求较高(如：培养温度要求一致，比色管的清洁等)，另外，任何影响液体培养基内微生物生长的因素都会影响抗生素效价的测定，这是其缺点。因此，随着大量单组分抗生素采用HPLC法测定含量，浊度法将成为不易采用HPLC法的抗生素和多组分抗生素效价测定的主流。12.去羟基阿奇霉素。

　　参考文献

　　1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版二部).化学工业出版社，2005:82.

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