双光径浊度仪在疫苗细菌浓度检测上的应用

来源:http://www.shuizhifenxi.com/ 作者:余氯检测仪 时间:2018-07-25

  1977年美国许可了14价肺炎球菌多糖疫苗和4价流脑疫苗后,这些荚膜多糖的检测标准均为依靠物化和血清学的分析方法分析大量粉剂。随后又发展了一种免疫电泳的方法用来测定肺炎成品疫苗中的多糖含量。

  经试验发现速率比浊仪(LSR nephelomety)除了被用于分析抗原抗体之间的动态反应来检测蛋白浓度外,还可用来定量测定多糖。

  在23价肺炎球菌多糖疫苗成品质控项目中,23型肺炎球菌多糖定量是疫苗的重要检测项目之一。速率散射浊度法(LSR)则是测定各型肺炎多糖含量的主要方法。因为利用了抗原抗体的特异性反应,所以可以准确地检测23价肺炎多糖疫苗中各型多糖的含量。不同于普通化学检测方法无法准确区分各型肺炎球菌多糖,该方法更为精确,并有较高的灵敏度。丰临科技的双光径免疫浊度分析仪的工作原理就是基于速率散射浊度法。为此,我们对用IMMAGE测定8型肺炎球菌荚膜多糖进行了系统的评估,并讨论其检测实用性。

  1材料与方法

  1. 1肺炎球菌多糖

  8、19F、5、17F、33F、10A六个型别的肺炎球菌精制多糖。1.2血清

  8型肺炎血清来源于丹麦国立血清研究所。

  1.3相对标准品

  各项生化检测指标均合格的肺炎精制多糖,经冻干衡重,精确标定后,保存备用。

  1.4仪器

  贝克曼库尔特公司生产的双光径免疫浊度分析仪(IMMAGE),UDR试剂盒以及配套的缓冲液buffer 1、稀释液dilution 1,由贝克曼库尔特公司提供。

  1.5方法

  先将相对标准品放入IMMAGE的样品盘中,将血清倒入试剂盒放入试剂盘中,进入IMMAGE的用户自定义试剂(UDR)系统,使用自建的用户自定义检测项目,进行定标,建立标准曲线。然后将检测样品放入样品盘中,用自定义检测项目测定样品。仪器可通过多点定标曲线自动计算样本中的多糖含量。

  1.6统计学处理

  采用Microsoft Excel 2003和SPSS统计软件处理检测数据。测定结果以x±s表示,两样本均数用t检验。

  2结果

  2.1重复性测定

  用8型肺炎球菌血清分别测定标示量分别为2.0、1.5、1.0的A、B、C3个8型肺炎多糖样品各10次,结果见表1。

  2.2回收率测定

  用8型肺炎球菌血清重复测定8型肺炎多糖样品10次,回收率为(99.25±0.02)%(表2)。

  2.3灵敏度

  用零浓度的空白液连续检测10次。测定结果为(0.120±0.016)μg/mL,计算分析灵敏度为0.2 μg/mL(表3)。

  2.4稀释实验

  将样品分别稀释15、20、30、40倍,重复检测3次,回收率为96.40% ~ 104.35%,平均值为99.82% 。回归方程为:Y=28.759X + 0.0369,r = 0.998(表4)。

  2.5标准曲线的稳定性

  用相对标准品配制3个浓度的标准校准物,将标准校准物作为样品检测,每天测定1次,每次双份测定,连续5 d。经t检验,校准物的测定结果与定值比较,差异无统计学意义(P>0.05),标准曲线至少可稳定5 d。

  2.6干扰实验

  采用配对差异试验法,建立8型肺炎球菌多糖样品对照组和加入3个浓度的干扰物的试验组,每组样品同时测定3次。计算干扰百分率(P)。干扰物为8、19F、5、17F、33F、10A六个血清型的肺炎球菌多糖。检测结果干扰百分率(P)为1.35%~2.37%,配对t检验分析加入干扰物前后的肺炎8型多糖测定结果表明,8型肺炎球菌多糖样品中加入8、19F、5、17F、33F、10A六个型别的肺炎多糖及浓度对IMMAGE测定8型肺炎球菌多糖无明显干扰(P>0.05)。

  3讨论

  23价肺炎球菌多糖疫苗含有1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23个血清型的肺炎球菌多糖。疫苗中各型肺炎多糖含量是一个重要的质量指标。目前速率散射浊度法(LSR)是定量测定多价肺炎球菌多糖疫苗的重要方法之一。该方法是建立在免疫反应聚合物形成速率的基础上,同时由于抗原抗体反应的特异性,LSR法能够区分并准确测定出23价肺炎多糖疫苗中各个血清型的多糖含量。起初该方法是被广泛用于研究蛋白抗原与它的特异性抗体的反应[1],用在检测多糖抗原抗体反应方面不多。

  双光径免疫浊度分析仪(IMMAGE)由于采用了近红外波长检测手段和颗粒包被技术使其检测精密度大大提高。并且IMMAGE的用户自定义试剂(UDR)系统方便了用户建立自定义检测项目,用户可以根据实际工作需要自行编辑反应参数,如样品、试剂的用量、反应时间、反应类型等。在用户对自定义项目定标完成后,该系统可以根据用户的选择自动计算标准曲线,显示相关参数,用户可以节约自己换算的时间。并且,电脑会自动存储标准曲线的数据,在检测样品时自动计算结果。IMMAGE采用封闭式自动化检测系统,其加样、稀释、反应、洗涤和分析等快速全自动化,在15min内可获得测定结果,可作为多价肺炎多糖疫苗定量测定手段。本文结果表明,IMMAGE测定8型肺炎球菌多糖具有较好的精密度、重复性,CV均小于5%,测定样品时有较好的回收率,回收率为(99.25±0.02)%。分析灵敏度为0.2 μg/mL。此法有较好的稀释线性,平均回收率为99.82%。标准曲线至少可以稳定5 d。加入19F、5、17F、33F、10A五个型别的肺炎球菌多糖(含量<100 μg/mL)对检测无显著性干扰。初步的研究结果证明,采用IMMAGE定量测定23价肺炎球菌多糖疫苗样品中8型肺炎多糖含量是准确、可靠的,有较高的灵敏度和精密度,并且快捷、高效。

  4参考文献

  [1]Chi-Jen lee. The Quantitatative Immunochemical Determination of Pneumococca Capsular Polysaccharide by Light scatlering Quantitative Rate Nephelornetry of Biol[J]. Stand,1983,11:55-64.

细菌浊度仪WGZ-XT

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